如何系统全面的评价qPCR仪!

  荧光定量PCR的检测离不开荧光定量PCR试剂和荧光定量PCR仪器。试剂的评价前面已经讲了（）。但是每次提到荧光定量PCR仪的评价，大家总是望而却步。一方面原因是荧光定量PCR仪涉及很多温度、光电信号要专业的设备来评估，另一方面也确实不知道从哪里入手。今天我梳理一下评价荧光定量PCR仪的指标和方法。由于本人非计量相关专业，文中有几率存在错误，本文仅供参考，你们可以参照有关标准进行评价。

  通过物理方法测定PCR性能的试验。最重要的包含测定温度和荧光来进行评价，由于要专业的设备，建议联系计量部门或仪器厂家进行有关指标的测定。

  编辑并运行一个温度循环文件，在55±5℃，72±5℃，95±5℃各取一个温度点，设置恒温2min，

  编辑并运行一个温度循环文件，在55±5℃，72±5℃，95±5℃各取一个温度点，设置恒温2min，5次循环，随机选取≥6个点位。温度差值在±1℃范围内。

  荧光定量 PCR 仪均热块温度上升或降低至设定值过程中，所有采样测量孔温度超出设定值的最大幅度，应≤3℃。过冲时间和过冲温度体现了qPCR仪器的性能，对qPCR实验程序的影响巨大，后面会用实验来说明过冲的影响。

  编辑并运行一个45℃和95℃之间循环的文件，设置温度≥1min，连续记录5个循环，

  通过物理方法测定PCR性能的试验。最重要的包含测定温度和荧光来进行评价，由于要专业的设备，建议联系计量部门或仪器厂家进行有关指标的测定。

  随机选取10个及以上个检测孔，用高中低浓度校准染料进行仔细的检测，各浓度校准染料重复测定的变异系数

  用高中低浓度校准染料各随机选择1个孔，重复检测10次，各浓度校准染料重复测定的变异系数

  2个通道，配置非目标通道的荧光染料溶液，其他通道荧光检测强度不高于目标通道荧光阈值。

  将已知浓度标准荧光染料梯度稀释后（至少稀释 5 个梯度）做测量，每一浓度梯度平行测试3孔，计算线。

  对温度敏感的PCR反应对PCR仪进行生化性能测试。该指标能够最终靠荧光定量PCR的试验对仪器进行评价，每个核酸检验测试实验室都可以开展的评价试验。

  将已知核酸浓度样本按照5倍或10倍梯度稀释后（至少稀释 5 个梯度），按照项目选用对应的试剂进行仔细的检测，每一浓度梯度平行测试3孔，计算线.

  对高中低浓度核酸样本做检测，每一浓度重复检测10次，计算Ct值变异系数应

  国内外有证标准物质，标准物质类型为质粒DNA或RNA。不推荐使用自制没有进行定量的质控品。

  需要使用经过验证过的荧光定量方法：扩增效率90%-110%（越接近100%越好）；R2大于0.99；最低检测限应低于10 copies/反应。

  常规荧光定量PCR反应条件，普通模式，40个循环。不建议使用快速模式和预扩增反应条件。

  选择高中低浓度标准物质进行仔细的检测（推荐浓度为5000 copies/反应、500 copies/反应和50 copies/反应），每个浓度至少5次重复，样品管随机放置在反应板中心和边缘的不同位置。Ct值变异系数不大于3%。

  对已知浓度的样品进行5倍或10倍梯度稀释（至少5个梯度），每一浓度梯度平行测试3孔，Ct均值的回归系数R不低于0.99。

  对已知浓度的标准荧光染料进行梯度稀释（至少5个梯度），每一浓度梯度平行测试3孔，回归系数R不低于0.99。

  如果检测中使用双重或多重荧光检测，可设计如用FAM探针扩增用VIC通道检测，检测结果不应该有高于阈值线的荧光信号。

  荧光定量PCR仪的评价需要结合物理性能（温度和荧光）和生化性能（荧光定量PCR反应）才可以获得仪器总体的表现。要专业的计量机构结合实验室的常用检验测试的项目（新冠、非瘟等）对qPCR仪进行系统性评价。核酸检验测试实验室日常使用已知浓度的有证标准物质定期对荧光定量PCR仪进行评价也至关重要。

  SN/T 2102.2-2008 食源性病原体PCR检测技术规范 第2部分：PCR仪性能测试要求